肿瘤是一类常见且多发的疾病，据世界卫生组织报告，恶性肿瘤已成为经济发达国家的主要死因，并且迅速上升为发展中国家的第二大死因(Chen et al., 2012)，因此攻克肿瘤是人们所面临的艰难挑战。当前早期肿瘤的治疗主要是手术治疗，而中晚期肿瘤则以放疗、化疗为主(Guo et al., 2012)。红景天(Rhodiola Rosea)是一种生长于东欧及亚洲高山、高寒地区的稀有药用植物之一(Panossian et al., 2010)，红景天的主要提取物为红景天苷(Salidroside)，而红景天苷是一种富含多糖类物质和免疫活性物质的传统中药。目前已被广泛用于预防高原病、抗衰老、抗氧化、抗抑郁、抗肿瘤、消除疲劳等方面。黄芪作为一种传统的扶正中药，在肿瘤临床上应用广泛。随着科学技术的进步，近年来的实验研究发现黄芪在恶性肿瘤中存在明显的抗癌作用，比如乳腺癌、肝癌、肺癌、胃肠道肿瘤、鼻咽癌(宋汉君等, 2011)等。从当前的研究来看，黄芪的抗癌作用的相关因素表现在很多方面，比如增强机体免疫功能、抑制肿瘤细胞增殖，促进肿瘤细胞凋亡，影响肿瘤细胞周期等。本课题组希望通过体外细胞学实验，进一步观察红景天苷联合黄芪注射液对人肝癌HepG2细胞的协同杀伤作用，并初步探讨其作用机制。

1结果与分析

1.1红景天苷和黄芪注射液单独使用和协同使用不同浓度时的效应

根据测量的OD450值按照公式计算出抑制率(fa) (表1)，可知红景天苷和黄芪注射液单独使用和协同使用时，其效应随着药物浓度的增加而增加。

表 1 两药单独使用和协同使用不同浓度时的效应(fa) (n=9)

1.2红景天苷和黄芪注射液单独使用和协同使用时中效浓度、斜率和相关系数

从表1我们可以看出，两种抗肿瘤药物单独使用和协同使用时，不同药物浓度下的效应为fa (作用部分)，而根据公式(王英婷等, 2011) fu (非作用部分)=1-fa，Y=log fa/fu，将D与Y分别取对数，然后在进行直线回归，从而可推算出斜率m以及截距a，依据此公式logDm=-a/m，分别取反对数后可得出中效浓度Dm (表2)。结果显示红景天苷的中效浓度为4.982 mg/mL，而黄芪注射液的中校浓度为142.349 mg/mL，提示红景天苷的抗癌强度高于黄芪注射液。两药合用时的中效浓度为123.271 mg/ml (其中红景天苷为1.220 mg/mL, 黄芪注射液为122.051 mg/mL)。

表 2 两药单独使用和协同使用时的中效浓度、斜率和相关系数

1.3红景天苷和黄芪注射液合用在不同效应时的合用指数

根据合用指数的计算公式，得出红景天苷和黄芪注射液合用时在不同效应(0.9, 0.8, 0.75, 0.7, 0.65, 0.6, 0.55, 0.5, 0.4, 0.3, 0.2, 0.1)的合用指数(CI)依次为0.754、0.867、0.911、0.952、0.990、1.027、1.065、1.102、1.183、1.278、1.404、1.618。由此可见当fa>0.65时CI<1，两药为协同效应，当fa<0.60时CI>1，两药为拮抗效应(图1) (王英婷等, 2011)。

图 1 红景天苷和黄芪注射液不同效应时的合用指数

2讨论

红景天苷(宋汉君等, 2011)是一种富含多糖类物质以及免疫活性物质的传统中药，目前已广泛用于预防各类疾病，比如高原病、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗抑郁、消除疲劳等。据报道，红景天苷(庞晓斌等, 2014)可能通过上调Bax、caspase-3、caspase-8以及下调Bcl-2蛋白表达，诱导肝癌细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞生长，发挥其突出的抗肿瘤作用(Hu et al., 2010)。

黄芪是一种多年的生豆科植物，最早出现在《神农草本经》，是一种传统的重要益气类中药，性温、味甘，有利尿、退肿、补气、固表、托毒生肌等功效。近年来有研究报道，黄芪在体内和体外均有抗肿瘤作用(Cho and Leung, 2007)。其作用机制可能与调节机体免疫功能、抑制肿瘤血管的形成、抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞发生凋亡、影响机体氨基酸代谢有关(丁繁和王小虎, 2013)。

当两种药物联合应用(王英婷等, 2011)时，一般可根据Chou-Talalay联合指数法(中效原理) (Chou and Talalay, 1984)，定量分析其药物效应来判断药物的作用是协同、相加还是拮抗，进而筛选出比较敏感的联合用药方案。

本研究分别检测了红景天苷和黄芪注射液两种药物单独使用以及联合使用时对体外培养的人肝癌 HepG2细胞生长的影响，结果显示，两药均对人肝癌 HepG2 细胞呈抑制作用且具有明显的量效关系，提示两者在体外对肝癌(刘盛楠等, 2015)均具有一定抗癌活性。

从表2可看出两药联合应用时的IC50较单药明显减小, 红景天苷单独使用时的IC50为4.982 mg/mL，联合使用时的IC50为1.22 mg/mL；黄芪注射液单独使用时的IC50为142.349 mg/mL，联合使用时的IC50为122.051 mg/mL。我们发现两种药物小剂量联合应用时能达到两药单用很大剂量才能达到的效果，这表明联合用药具有小剂量、高效应的优势。所以，如在临床上联合应用药物治疗肝癌,应该选择能达到最佳效应的最小剂量，从而减小药物的毒副作用。

从两者合用时的效应和合用指数(CI)可以看出，在fa＞0.65时，CI<1，当fa<0.65时，CI＞1，即两种药物在大剂量时合用时效应为协同(CI<1)，在小剂量时合用时效应为拮抗(CI>1)；因此我们认为只要找出两种药物的一个合适的药物浓度比例，就有可能在保证红景天苷疗效不变的同时，降低不良反应产生的风险(王英婷等, 2011)。本实验结果表明，当红景天苷的效应达到0.75的时候，单独使用红景天苷的剂量应为10.538 mg/mL，我们如果用合用指数公式推算一下，当两药合用，要到达同样的效果，实际上红景天苷的药物浓度仅为2.261mg/mL (为单用时的21.5%)、黄芪注射液为226.089 mg/mL (为单用时的69.6%)，这说明两药联用可以在保证较高效应的同时减少两药各自的用量，从而减少药物不良反应，也为肝癌的联合治疗提供了有价值的参考依据，但尚需临床进一步研究。

3材料与方法

3.1实验细胞

实验用人肝癌HepG2细胞由广西医科大学组胚教研室馈赠。

3.2试剂

(1)红景天苷：购自上海源叶生物科技有限公司。(2)黄芪注射液:购自神威药业集团有限公司。(3) RPMI-1640：购自美国Hyclone公司。(4)胎牛血清：购自美国Gibco公司。(5)青链霉素：购自北京索莱宝公司。(6) CCK-8：购自日本同仁公司。

3.3仪器

YJ.875医用超净台(吴江市空气净化设备厂)；台式离心机(德国Eppendorf公司)；CO₂培养箱(美国thermo公司)；Bio-Rad500酶标仪(美国伯乐公司)。

3.4实验方法

3.4.1人肝癌HepG2细胞的培养

人肝癌HepG2细胞用RPMI-1640培养基配成的完全培养基(含12%胎牛血清, 青霉素100 U/mL和链霉素100 mg/L)培养，隔天换培养液，细胞生长满单层细胞瓶后，以0.25%胰蛋白酶消化传代4 min后，加入含12%胎牛血清的RPMI-1640培养液终止消化，吹下贴壁细胞后重悬，分至新细胞培养瓶，加培养液，置于37℃，5% CO2的培养箱内孵育，取对数生长期人肝癌HepG2细胞用于本实验。

3.4.2 Cell Counting Kit-8法(张霞等, 2005)检测药物效应

采用CCK-8法分别检测红景天苷和黄芪注射液两药的单独使用和联合使用时的效应。我们的实验分组设无任何药物的对照组以及不同浓度梯度的药物实验组，将人肝癌HepG2细胞培养至对数生长期，消化后制成浓度为5×104个/mL的细胞悬液，用移液器按照每孔100 μL分别加入96孔细胞培养板中，过夜，移液器弃去培养液，实验组加入含不同浓度红景天苷和黄芪注射液的培养液100 μL，使红景天苷的终浓度分别为0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL，黄芪注射液的终浓度分别为50 mg/mL、100 mg/mL、200 mg/mL、400 mg/mL、800 mg/mL；两药合用比例为1:1方案。而对照组以及空白组分别给予体积相同且不含任何药物的RPMI-1640完全培养基，每组5个复孔。孵育48 h后，每孔加入CCK-8试剂10 μL继续培养2 h，于自动酶标读数仪450 nm波长处测定各孔吸光度(OD)值，计算每种药物浓度的抑制率，重复3次，数据取平均值。

3.4.3结果判定方法

在自动酶标读数仪(Bio-Rad500型)上，波长450 nm处检测各孔的光吸收值(OD值)。根据以下公式(王英婷等, 2011)计算抑制率。药物的作用效应(fa)即抑制率=《(对照组OD-试验组OD)/(对照组OD-空白组OD)》×100%。依据中效方程式fa/fu=(D/Dm)m，两边分别取对数得到log(fa/fu)=mlogD-mlogDm，设：y=log(fa/fu)，x=logD，a=-mlogDm (m为斜率, 设m=b)，从中可以得到直线方程式：y=bx+a，其中，fu为肿瘤细胞存活率，fu=1-fa；D为药物浓度，Dm为中效浓度(即达到0.5效应时的药物浓度)。

依根据以上公式我们可以算出两药物单独使用以及联合使用时各自的中效浓度Dm(logDm=-a/b)，然后再分别算出两种抗肿瘤药物单独使用时在各个不同效应时所需的药物浓度D=Dm(fa/fu)1/m，最后算出两种抗肿瘤药物联合使用时在各个不同效应时的合用指数(CI)=D1/Dx1+D2/Dx2+αD1D2/Dx1Dx2，我们知道D1、D2是两药联合使用，当产生X效应时，两药分别需要的药物浓度，而Dx1、Dx2是两药单独使用，当产生X效应时两药的药物使用浓度。而α是常数，假设两种药物相互排斥，则α=0，假设两种药物相互非排斥，则α=1。红景天苷和黄芪注射液的相互作用是非排斥，所以取α=1。当CI<1的时候，两药的作用为协同效应；当CI=1的时候，两药的作用为相加效应；当CI>1的时候，两药的作用为拮抗效应。

作者贡献

陈红红是整体实验的主要完成人，负责数据分析及处理，撰写论文；莫书荣是实验课题的选定及技术路线的设计及论文校审；吴忧负责试剂及耗材的订购、实验仪器的清洗。

致谢

本研究由广西高校科学技术研究项目(No.2013YB050)资助。

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